Helveticin-M与绿原酸复配对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的抑菌...

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Helveticin-M与绿原酸复配对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的抑菌效果及其机制
王虹懿1,2，刘 芳1,3，孙芝兰1,3,*，苏萌萌1，诸永志1，王道营1，徐为民1，彭 景2,*
（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；3.江苏省农业科学院农产品质量与营养安全研究所 省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室，江苏 南京 210014）
摘 要：以大肠杆菌（Escherichia coli）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）为指示菌，利用生长曲线测定和细菌活性实验研究Helveticin-M、绿原酸及二者复配的抑菌效果。通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）胞外ATP浓度检测，探讨经Helveticin-M、绿原酸不同处理对指示菌形态结构和细胞膜通透性的影响。结果表明：与Helveticin-M或绿原酸单独作用相比，二者复配处理后指示菌生长减缓，OD600 nm明显下降，在3 h内指示菌活菌数显著减少，在二者协同作用下抑菌效果显著增强（P＜0.05）；SEM观察显示复配处理后指示菌较单独处理时细胞表面损伤更为严重；CLSM分析结果也表明复配处理后指示菌细胞膜通透性明显增强，且Helveticin-M+绿原酸复配处理可显著提高胞外ATP浓度（P＜0.05）。因此，Helveticin-M与绿原酸复配处理主要通过增强大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的细胞膜通透性，影响细菌正常生长繁殖，增强抑菌作用。该研究为扩大Helveticin-M与绿原酸的产业应用提供了参考。
关键词：Helveticin-M；绿原酸；大肠杆菌；肠炎沙门氏菌；协同作用；抑菌机制
肉类是人类日常膳食中优质蛋白质的主要来源之一，营养十分丰富，但其高营养成分极易被微生物利用从而影响其食用品质和安全性[1]。在屠宰、运输、加工和贮藏过程中，以肉品为传播媒介的致病性细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等已在鸡肉、猪肉、牛肉及其他肉类食品中被检出[2-3]，严重危害消费者健康，是引发食源性疾病的主要原因之一。因此避免微生物的污染及抑制其在肉品中的生长繁殖是控制和保障肉品质量安全的关键所在。
目前控制禽畜肉类微生物的主要措施仍是添加化学防腐剂，在健康意识越来越强的今天，由于化学防腐剂存在诸多缺陷，其高残留、高毒性等化学副作用使常见化学防腐剂受到越来越多消费者的排斥，因此现今食品安全加工工业更加倾向使用天然防腐剂。细菌素是蛋白类抑菌物质，作为微生物的代谢产物，是潜在的天然食品生物防腐剂，因其具有无毒、无副作用、无残留、无抗药性的特性而受到食品行业的青睐[4]。目前研究最彻底并获得美国食品药品监督管理局批准为食品防腐剂的细菌素——乳酸链球菌素（Nisin），已作为食品添加剂在全球范围内得到广泛应用[5]；但其抗菌谱较窄，因为外膜的存在使得Nisin不能到达作用位点而对革兰氏阴性细菌抑菌作用很小[6]。为了抵消这种影响，许多研究将细菌素与其他抑菌剂复配使用，有效地抑制了食品中腐败菌的生长。如将Nisin、茶多酚和壳聚糖进行复配并应用于肉类食品的保存中，发现Nisin、壳聚糖之间存在明显协同作用[7-8]，并能有效延长肉品的货架期；Nisin与ε-多聚赖氨酸、乳铁蛋白等新抗菌剂结合使用能够协同控制食物中的腐败菌[9-10]。
Helveticin-M是卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）K313代谢合成的广谱高效细菌素，本课题组前期已建立Helveticin-M的异源表达及提取纯化方法，分析了该细菌素的抗菌活性和作用机理，确定其在肉制品防腐应用中的潜力[11]，但Helveticin-M抑菌谱较窄，如何降低其在肉品中的使用浓度以及节约成本仍是亟待解决的问题。绿原酸是具有抑菌活性的天然植物源生物防腐剂[12]，目前，许多研究表明从植物中提取和分离的绿原酸对多种腐败菌具有一定的抑制效果[13-16]。本实验将微生物源生物防腐剂细菌素与植物源生物防腐剂绿原酸进行复配，研究III型细菌素Helveticin-M和绿原酸协同处理对指示菌（大肠杆菌、肠炎沙门氏菌）的抑菌效果及其作用机制，阐明二者协同作用抑制革兰氏阴性菌的作用机理，为开发新型有效食品防腐剂及预防食源性疾病抑菌物质提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Helveticin-M由江苏省农业科学院农产品加工研究所畜禽组前期构建在大肠杆菌中异源表达，并分离纯化；指示菌株（大肠杆菌、肠炎沙门氏菌）从冷鲜鸡肉中自主分离获得。
LB培养基（1.5%琼脂粉、1%氯化钠、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物，均为质量分数） 实验室自制；绿原酸（杜仲提取物，纯度98%） 陕西慧科植物开发有限公司；LIVE/DEADTMBacLightTM荧光染色试剂盒美国Invitrogen公司；增强型ATP检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
JY5002型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；UniCenMR台式高速冷冻离心机 德国Herolab公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；JS-600W电泳仪、JS-680C凝胶成像系统 上海培清科技有限公司；超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Gen5全波长酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；Ultra View VOX激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM） 美国珀金埃尔默公司；EVO-LS10扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 德国Carl Zeiss公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的活化与培养
将从鸡肉样品中分离得到的指示菌大肠杆菌、肠炎沙门氏菌接种于LB平板培养基中，37 ℃培养12 h。挑取典型的单菌落接种于新鲜LB液体培养基中，于37 ℃摇床培养（200 r/min）生长至对数期，按体积分数2%的接种量再次转接于新鲜LB液体培养基中，活化传代2 次备用。
1.3.2 Helveticin-M的表达、分离及纯化
挑取构建好的pCNCH-Helveticin-M单菌落接种于带有氨苄抗性（Amp+）的LB液体培养基中。37 ℃、200 r/min培养过夜，按体积分数2%接种于500 mL LB（Amp+）抗性培养基中继续培养至OD600 nm＝0.8时，加入1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于22 ℃诱导培养过夜。菌液诱导表达后12 000 r/min离心10 min收集菌体，生理盐水洗涤2 次，将沉淀重悬于50 mL结合缓冲液中，利用细胞破碎仪进行超声破碎，破碎后的样品于12 000 r/min下离心20 min，收集上清液，利用标准镍柱纯化方法纯化、透析，收集Helveticin-M备用[17]。
1.3.3 Helveticin-M与绿原酸复配处理对指示菌生长曲线的影响
活化得到的指示菌按体积分数2%接种于LB液体培养基中，分别添加纯化的Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M与绿原酸复配溶液，使其终质量浓度分别为200 μg/mL[16]、2.5 mg/mL[18]和200 μg/mL Helveticin-M+2.5 mg/mL绿原酸，作为处理组。以相同体积的LB液体培养基作为对照组。将菌液于37 ℃静置培养，每隔1 h测定OD600 nm，实验重复操作3 次，每次设置3 个平行，记录并绘制生长曲线。
1.3.4 活菌数的测定
将活化后的大肠杆菌和肠炎沙门氏菌按体积分数2%接种于LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养至对数期（OD600 nm值为1.0左右）时，4 ℃、12 000 r/min离心3 min，无菌收集菌体沉淀，用5 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）悬浮菌体，分别取1 mL菌悬液置于不同离心管中，分别添加与1.3.3节相同终质量浓度的Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M与绿原酸复配溶液，作为处理组。以加入相同体积的PBS作为对照组。将菌悬液放入37 ℃、200 r/min摇床培养，分别培养0、10、20、60、120、180 min时取样，使用生理盐水按照10 倍递增稀释法稀释样品至相应菌体浓度，分别取100 μL各稀释样品均匀涂布于LB固体平板上，30 ℃培养24 h后记录菌落总数（lg（CFU/mL））[19]。实验重复3 次，每次重复设置3 个平行，结果取平均值。
1.3.5 细胞形态的观察
按1.3.4节步骤制备对照组和处理组细菌悬液。将上述所有样品于37 ℃、200 r/min摇床培养3 h，取出菌液于6 000 r/min、4 ℃下离心10 min，收集菌体，PBS冲洗2 次，加入体积分数2.5%的戊二醛缓冲液固定。于4 ℃ 2 500 r/min离心4 min，加超纯水静置10 min后按上述条件再次离心，重复操作3 次；用体积分数50%、70%、80%、90%乙醇溶液对样品进行梯度洗脱，每次静置15 min；6 000 r/min离心2 min后加入无水乙醇静置30 min，再次离心，重复操作3 次。最后将样品固定于镜片上，通风橱中风干、喷金，采用SEM观察并采集图像[20]。
1.3.6 细胞膜通透性分析
1.3.6.1 胞外ATP浓度测定
通过测定指示菌细胞外ATP浓度变化，分析不同抑菌物质对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌细胞膜通透性的影响[21]。按1.3.4节步骤制备对照组和处理组细菌悬液。将上述所有样品于37 ℃、200 r/min下摇床培养，分别在培养0、10、20、30、60、90、120 min时取样，12 000 r/min离心10 min后取上清液置于冰上暂存待用。参照增强型ATP检测试剂盒说明书要求处理样品，用化学发光酶标仪检测荧光值，计算ATP浓度。实验重复操作3 次，每次重复设置3 个平行。
1.3.6.2 CLSM检测
使用荧光探针SYTO-9和碘化丙啶（propidium iodinate，PI）按照一定比例调配染色，分别用于标记活体细胞和死细胞。取按1.3.4节步骤制备的对照组和处理组细菌悬液各100 μL，10 000 r/min离心2 min，收集菌体，PBS重悬，加入LIVE/DEADTM BacLightTM试剂盒中的荧光染料3 μL进行染色，37 ℃黑暗孵育30 min后6 000 r/min离心5 min，收集菌体，PBS冲洗，重复操作3 次，最终将菌体悬浮在200 μL PBS中。吸取2～3 μL菌液于玻片，在CLSM下用100 倍油镜观察并拍照[22]。
1.4 数据处理与分析
使用SPSS 16.0软件进行统计分析，采用最小显著差异法进行分析，P＜0.05表示差异显著；采用Origin 8.5软件制图。
2 结果与分析
2.1 Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M与绿原酸复配处理对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌生长的影响
图1显示了单独添加Helveticin-M、绿原酸及将二者复配后处理对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌生长的影响。与未添加抑菌物质的对照组相比，用Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M+绿原酸复配溶液处理后，两株指示菌生长均受到抑制，其中复配处理组的生长抑制效果最明显。由图1A可知，对照组大肠杆菌经过前3 h的生长迟缓期后，菌体进入对数生长期，培养至12 h时菌体进入稳定期。绿原酸和Helveticin-M单独处理组大肠杆菌的生长速率受到一定抑制，复配处理组大肠杆菌在培养7 h时菌体浓度才明显上升，至培养12 h时其OD600 nm仅为1.331，明显低于对照组和单独处理组，说明Helveticin-M+绿原酸复配处理更为明显地抑制了大肠杆菌的生长。由图1B可知，对照组肠炎沙门氏菌在培养0～2 h处于生长迟缓期，培养2 h后进入对数生长期。而经过不同抑菌处理后，3 组肠炎沙门氏菌生长迟缓期均延长了1 h，随着培养时间的延长，复配处理组肠炎沙门氏菌生长受到的抑制最为明显，培养12 h时OD600 nm仅为1.235。

图 1 Helveticin-M、绿原酸或Helveticin-M绿原酸复配溶液处理的大肠杆菌（A）和肠炎沙门氏菌（B）的生长曲线
Fig. 1 Growth curves of E. coli (A) and S. enteritidis (B) in the presence of Helveticin-M and/or chlorogenic acid
2.2 Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M与绿原酸复配处理对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌活菌数的影响
由图2可知，与对照组相比，2.5 mg/mL绿原酸单独处理3 h后，大肠杆菌和肠炎沙门氏菌活菌数分别下降约30.1%、21.2%；经200 μg/mL Helveticin-M单独处理3 h后，大肠杆菌和肠炎沙门氏菌活菌数分别下降约44.4%和37.4%；Helveticin-M+绿原酸复配处理3 h后，大肠杆菌肠活菌数下降约74.1%，肠炎沙门氏菌活菌数下降约61.7%，与单一抑菌剂相比抑菌效果更明显。说明Helveticin-M与绿原酸复配时增强了杀菌效果。

图 2 Helveticin-M、绿原酸或Helveticin-M绿原酸复配处理
对大肠杆菌（A）和肠炎沙门氏菌（B）活菌数的影响
Fig. 2 Effects of Helveticin-M and/or chlorogenic acid on viability of E. coli (A) and S. enteritidis (B)
2.3 Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M与绿原酸复配处理对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌细胞形态结构的影响

图 3 Helveticin-M、绿原酸或Helveticin-M绿原酸复配处理前后大肠杆菌（A）和肠炎沙门氏菌（B）的SEM图
Fig. 3 SEM images of E. coli (A) and S. enteritidis (B) before and after treatment with Helveticin-M and/or chlorogenic acid
通过SEM观察不同抑菌处理对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌形态结构的影响。如图3所示，未经处理的对照组指示菌细胞完整且独立，细胞膜平滑，细胞体饱满圆润。200 μg/mL Helveticin-M处理后，大肠杆菌菌体细胞出现少量塌陷，胞膜表面变得褶皱不平整，呈现皱缩状态；肠炎沙门氏菌失去圆滑的圆杆状，形态变得轻微不规则。2.5 mg/mL绿原酸处理后，大肠杆菌菌体表面粗糙，有少许程度的扭曲凹陷，肠炎沙门氏菌菌体相互堆叠。Helveticin-M+绿原酸复配处理后，2 种指示菌菌体开始出现溶胀、扭曲，细胞表面粗糙加重、褶痕变多，形态严重遭到破坏，大肠杆菌和肠炎沙门氏菌胞外均有明显的内容物泄漏，肠炎沙门氏菌菌体表面出现明显的孔洞，细胞膜受损最为严重。以上结果表明，Helveticin-M与绿原酸复配作用后明显改变了指示菌细胞的外部结构和形态，对细胞质膜结构的破坏效果明显，造成胞膜组分溶解，胞内物质大量析出，从而抑制菌株的生长。
2.4 Helveticin-M、绿原酸和Helveticin-M与绿原酸复配处理对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌细胞膜通透性的影响
2.4.1 CLSM观察结果

图 4 Helveticin-M、绿原酸或Helveticin-M绿原酸复配处理前后大肠杆菌（A）与肠炎沙门氏菌（B）的CLSM图
Fig. 4 CLSM E. coli (A) and S. enteritidis (B) before and after treatment with Helveticin-M and/or chlorogenic acid
用荧光染料对菌体进行染色后，通过LSCM观察荧光颜色变化情况，进而确定不同抑菌条件处理对细胞膜通透性的影响[23]。经SYTO-9和PI两种荧光染料染色后，SYTO-9能够进入具有完整细胞膜结构的细胞，呈现绿色荧光，而PI作为一种核酸染料，仅能进入受损及死亡细胞，并与DNA或RNA结合后产生红色荧光[24]。因此，染色后完整的细胞显示绿色荧光，破损的细胞则显示为红色荧光。如图4所示，对照组和经Helveticin-M或绿原酸单独作用后，2 种指示菌大部分菌体呈绿色荧光，仅能观察到少量黄色和红色荧光；依据图像中受损细胞数量计算得到，大肠杆菌经Helveticin-M或绿原酸单独处理后细胞受损率分别为5.33%和40.00%，肠炎沙门氏菌细胞受损率分别为13.25%和20.75%。经过Helveticin-M与绿原酸协同作用后，2 种指示菌中呈红色荧光的细胞数量明显增多，说明细胞膜受损严重，依据图像中受损细胞数量计算得到，Helveticin-M+绿原酸复配处理30 min大肠杆菌的细胞受损率达到73.68%，肠炎沙门氏菌的细胞受损率为58.46%，且观察到复配处理后红色荧光细胞的荧光强度高于对照组中绿色荧光强度，这与上述不同处理方式对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌活菌数的影响结果相对应。CLSM观察结果表明，对照组与单独处理组样品中绝大多数菌体细胞的细胞膜完整，经复配处理后，随着细胞膜完整性被破坏及通透性增加，PI透过受损细胞膜进入细胞与SYTO-9竞争取代结合位点，呈现红色荧光。
2.4.2 胞外ATP浓度检测结果

图 5 Helveticin-M、绿原酸或Helveticin-M绿原酸处理对大肠杆菌（A）和肠炎沙门氏菌（B）的胞外ATP浓度的影响
Fig. 5 Extracellular ATP levels of E. coli (A) and S. enteritidis (B) in the presence of Helveticin-M and/or chlorogenic acid
由图5可知，经不同抑菌条件处理后2 种指示菌胞外ATP浓度均在短时间内均发生一定程度的泄漏。与对照组相比，Helveticin-M、绿原酸及二者复配处理20 min后，胞外ATP浓度均有所增加且渐趋稳定。对于大肠杆菌菌株，2.5 mg/mL绿原酸处理2 h后，胞外ATP浓度为128 nmol/mL，相比之下，200 μg/mL Helveticin-M处理2 h后胞外ATP浓度升高至160.52 nmol/mL，而Helveticin-M与绿原酸协同作用后细菌胞外ATP在30 min内迅速增加至172.7 nmol/mL，培养2 h后增加至310.47 nmol/mL。而对于肠炎沙门氏菌，培养2 h内，对照组和绿原酸处理组胞外ATP浓度变化不明显，基本保持在20 nmol/mL内，Helveticin-M处理组胞外ATP浓度增加至46.71 nmol/mL，而用Helveticin-M与绿原酸协同处理诱导细胞内大量ATP泄漏，培养2 h后细菌胞外ATP浓度增加至94.15 nmol/mL，表明Helveticin-M与绿原酸协同作用使细胞膜通透性明显增加，胞内物质泄漏加剧。
3 讨 论
由于许多天然抗菌剂的最小抑菌浓度较高，有的仅在极高浓度下才能达到抑菌效果，而将单个细菌素与其他抗菌剂联合作用后抑菌效果明显增强[25]，协同作用后将具有较大的应用潜力。
本实验首先研究了由卷曲乳杆菌产生的III型细菌素Helveticin-M（200 μg/mL）、绿原酸（2.5 mg/mL）和两者复配对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的抑菌作用，发现Helveticin-M与绿原酸协同作用可增强二者的抑菌活性和杀菌活性。二者复配处理后细菌活菌数在3 h内分别下降约0.5和0.27 个对数级，这可能是因为二者对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌主要表现为抑菌作用而非杀菌作用。一些非热处理方法也可对指示菌造成亚致死损伤[11]，抑制它们的生长，但这种亚致死细胞能在良好环境条件（营养、水分、pH值和温度）中恢复。为了抵消这种影响，可以与其他物理方法（如超声波或高强度脉冲电场）联合作用，进一步杀死食品中的致病菌。
其次，通过SEM进一步检测大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的细胞形态发现，Helveticin-M和绿原酸复配处理后指示菌细胞膜损伤和胞内物质泄漏更为明显，推测二者协同作用造成指示菌株细胞膜的损伤，使细胞膜通透性增加。研究表明，绿原酸可作用于革兰氏阴性菌如大肠杆菌的脂多糖层，改变细胞外膜的通透性[26]。位于革兰氏阴性菌细胞膜和肽聚糖层外的外膜层是阻挡细菌素（如Nisin）到达细胞膜的屏障，使得细菌素不能到达作用位点从而影响其抑菌效果[27]。CLSM观察结果与胞外ATP浓度测定结果表明，绿原酸可能破坏了指示菌外膜，帮助Helveticin-M嵌入指示菌细胞膜并形成孔洞，导致内膜通透性增加，进而引起胞内物质泄漏，这也与已报道的ε-多聚赖氨酸、Nisin和乳酸3147之间所表现出的协同作用相似[28-30]。利用多种防腐剂协同作用能够高效控制微生物的生长增殖，这是因为不同的防腐剂具有不同的作用位点，它们同时作用于目标指示菌时，可建立多重破坏指示菌的方式。另外，抗菌剂的协同使用能够加强抗菌剂的效果，减少抗菌剂的最低有效剂量，节约使用成本[31]。
4 结 论
Helveticin-M和绿原酸对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌具有协同抑制作用，Helveticin-M和绿原酸协同发挥作用既能高效抑制大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的生长，又能降低使用抑菌剂时的质量浓度。Helveticin-M与绿原酸复配主要是通过破坏大肠杆菌和肠炎沙门氏菌细胞膜，增加细胞膜通透性，导致胞内物质泄漏来抑制细菌的正常生长。Helveticin-M和绿原酸协同作用是一种新型的抗菌组合，可以用于食品工业中肉制品的保存，为之后进一步探究“栅栏技术”在食品安全中的应用提供理论支撑。
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Synergistic Antibacterial Effect and Mechanism of Helveticin-M Combined with Chlorogenic Acid on Escherichia coli and Salmonella enteritidis
WANG Hongyi1,2, LIU Fang1,3, SUN Zhilan1,3,*, SU Mengmeng1, ZHU Yongzhi1, WANG Daoying1, XU Weimin1, PENG Jing2,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;2. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China;3. Key Laboratory of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base, Institute of Agricultural Product Quality and Nutritional Safety, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)
Abstract: The objective of this study was to explore the synergistic antimicrobial effect of Helveticin-M combined with chlorogenic acid against Escherichia coli and Salmonella enteritidis by examining growth curves and cell viability.Furthermore, the morphology, structure and membrane permeability of the indicator bacteria were characterized by scanning electron microscopy (SEM), confocal laser scanning microscopy (CLSM) and extracellular ATP analysis. The results showed that the synergistic effect of Helveticin-M combined with chlorogenic acid was markedly increased when compared with either antibacterial agent alone (P < 0.05). The structure of the bacterial cells subjected to the combined treatment was damaged seriously under SEM and CLSM examination, indicating increased permeability of the cytoplasmic membrane.There was a significant difference in extracellular ATP concentration between the combined treatment and either treatment alone (P < 0.05). In conclusion, the combination of Helveticin-M and chlorogenic acid exerted a notable synergistic antimicrobial effect by increasing membrane permeability and thereby leading to the leakage of intracellular components.This study provides a basis for expanding the industrial application of Helveticin-M and chlorogenic acid.
Keywords: Helveticin-M; chlorogenic acid; Escherichia coli; Salmonella enteritidis; synergistic effect;antimicrobial mechanism
引文格式：2019-02-28
基金项目：江苏省现代农业（克氏原螯虾）产业技术体系建设专项（JFRS-03）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31601530）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-41）；江苏省食品质量与安全重点实验室自主研究课题（jg201701）；江苏省政策引导类计划（苏北科技专项）项目（SZ-SQ2018033）
第一作者简介：王虹懿（1995—）（ORCID: 0000-0001-8914-6687），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。E-mail: Nikki95215@163.com
*通信作者简介：
孙芝兰（1984—）（ORCID: 0000-0001-9648-4115），女，副研究员，博士，研究方向为肉品安全与质量控制。E-mail: zhilan408@163.com
彭景（1962—）（ORCID: 0000-0001-9442-4442），女，副教授，本科，研究方向为营养与食品卫生学。E-mail: yzupj@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190228-229
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）03-0068-07
引文格式：王虹懿, 刘芳, 孙芝兰, 等. Helveticin-M与绿原酸复配对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的抑菌效果及其机制[J]. 食品科学,2020, 41(3): 68-74. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190228-229. http://www.spkx.net.cn
WANG Hongyi, LIU Fang, SUN Zhilan, et al. Synergistic antibacterial effect and mechanism of Helveticin-M combined with chlorogenic acid on Escherichia coli and Salmonella enteritidis[J]. Food Science, 2020, 41(3): 68-74. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190228-229. http://www.spkx.net.cn