酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵 细菌菌群结构多...

酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵 细菌菌群结构多样性分析
王 欢1，席德州2，黄永光1,*，曹文涛1，尤小龙2，程平言2，胡 2
（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州 习水 564622）
摘 要：利用高通量测序及其相关数理分析技术，对酱香型白酒机械化酿造7 个轮次堆积发酵酒醅的细菌16S rDNA片段进行分析，结果表明，7 个轮次中共检测出14 个门，456 个属。优势细菌门为Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes，核心细菌属为Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。其中，Caulobacter和Rhodococcus为机械化酿造过程中的特有菌属，可能来源于机械设备和环境。核心微生物菌属之间存在明显的生物学关系，Bacillus、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Pediococcus和Oceanobacillus之间呈现共生关系，而Acinetobacter、Caulobacter、Sphingomonas和其他9 个属呈负相关。发酵环境因子中，水分、酸度、淀粉含量对微生物群落结构影响较大，其中Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与淀粉含量显著正相关，与水分、酸度显著负相关；Caulobacter和Sphingomonas与淀粉含量显著负相关而与水分显著正相关，Sphingomonas与酸度显著正相关。本研究结果揭示了酱香型白酒机械化酿造堆积发酵过程中的核心细菌菌群结构，为酱香型白酒机械化酿造的理论研究和工程应用提供了理论支持。
关键词：酱香型白酒；机械化酿造；高通量测序；微生物菌群结构；堆积发酵；核心细菌群
酱香型白酒是中国最传统、最古老的三大香型白酒之一，也是华夏民族典型的发酵食品之一，以茅台酒为代表，其他名优酒有习酒、郎酒等。其酒体风格特征为“无色（或微黄）透明，酱香突出，幽雅细腻，醇厚协调，回味悠长，空杯留香持久”[1]。其独特的酿造工艺可概括为“高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒、生产周期长、贮存时间长、用曲量大、多轮次（发酵）取酒”[2]。其中，高温堆积发酵是酱香型白酒独特的生产工序之一，也是其酿造工艺中最难掌控的关键环节，具有“次制曲”之说[3]。堆积发酵过程可自然网罗、富集酿造环境中的微生物，形成独特的微生物菌群结构，其过程所富集的微生物菌群代谢产生丰富多的发酵酶类、风味物质对后期酒体酱香风味的形成具有重要作用[1]， 同时也为下一步窖池发酵提供充足的微生物储备[4-5]。其过程的菌群结构包括酵母菌、细菌、放线菌和霉菌等。其中，细菌是酱香型白酒酿造过程中重要的产香功能微生物，能够分泌代谢降解蛋白质及淀粉的水解酶类，对酒体的风味质量有着极大贡献和关键调控作用[4]。因，系统研究酿造过程的细菌菌群结构及其演替规律是科学认识和揭示其酿造品质的关键。
近年，蓬勃发展的高通量测序及其数理分析研究[6]为深入探索、解析复杂发酵体系的微生物菌群组成和结构提供了有效手段[7-10]。黄蕴利等[11]利用高通量测序研究了酱香型白酒传统酿造过程发酵酒醅中的微生物菌群结构，发现堆积酒醅中的优势细菌属为芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属和乳杆菌属。郭敏等[12]运用高通量测序技术对酱香型白酒传统酿造过程发酵酒醅的微生物菌群结构也进行了研究，揭示了发酵过程优势菌属与产酒之间的机制。李欣等[13]通过高通量测序技术对酱香型白酒传统酿造不同发酵阶段的优势菌属进行研究，揭示了优势菌属对酱香型白酒生产的功能作用。但上述研究主要集中在于单一轮次或传统酿造过程中菌群结构的研究，缺乏对整个轮次堆积发酵全过程系统性的研究和解析，也缺乏对各轮次微生物结构之间多性、异同性的系统分析。随着浓香白酒领域的洋河[14]、今世缘的高度机械化[15]，清香型的劲酒机械化快速发展[16]，在传统白酒行业掀起了新的机械化创新发展。机械化酿造不但可降低传统模式的劳动强度，还可提升酿造质量的稳定性和可控性。
为揭示机械化酿造过程中不同轮次堆积发酵微生物菌群结构的多性、差异性，利用高通量测序及其数理分析，对酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅中的微生物菌群结构及其多性等进行系统研究，为机械化酿造酱香型白酒的发展和工艺优化提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
品取自贵州习酒公司酱香型白酒机械化制酒车间，2016ü 2017年1～7轮次机械化酿造车间的堆积发酵酒醅。
DNA试剂盒 美国Omega BioTek公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物 北京全式金生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；E002092超净工作台 苏州市金净净化设备科技有限公司；数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；涡旋振荡器 北京同正生物技术发展有限公司；PCR仪 美国伯公司； 电泳仪 北京六一仪器厂；凝胶成像系统 上海培清科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 品采集
堆积发酵酒醅品采集周期为1 d，蒸酒酒醅经摊凉、下曲、拌匀、收堆后开始采集，收堆当天记为采的第1天，直至堆积发酵堆酒醅表层的酒醅顶温达到50 ℃时停止采。具体采方案如图1所示，A点为堆积发酵堆上层中点，B、C点为中层同一平面的两点（堆中心和堆表层部位的内表层），D、E为下层同一平面的两点（堆中心和堆表层部位的内表层）。同一天品采集后立即用无菌袋包装，在无菌条件下将A、B、C、D、E 5 个点采集的所有品均匀混合，20 ℃保存。再将上述同一轮次的采集品等份量混合均为1 个品（1 d所采5 个单品等量混合均匀代表1 d采集的品，再将每轮次每天采集的品再次等量混合均匀作为该轮次堆积品），最终，1～7轮次共获得7 个最终混合品（本研究1～7轮次总共采集酒醅品140 个小）。

图 1 堆积酒醅取样
Fig. 1 Sampling points for stacking fermented grains
1.3.2 品DNA提取
分别称取1.3.1节最后混合的7 个最终混合品各15 g，置于无菌离心管中，加入15 mL 0.1 mol/L无菌磷酸缓冲液和3 颗玻璃珠，涡旋振荡10 min，400 r/min低速离心5 min，收集上清液，沉淀用磷酸缓冲液洗涤，再涡旋振荡3 min，400 r/min低速离心5 min，收集上清液，重复3 次，混合收集上清液。将混合上清液12 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞沉淀。每个品的总DNA提取步骤参考土壤DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. Soil DNA Kit）操作说明书。
1.3.3 PCR扩增及凝胶电泳
细 菌 P C R 扩 增 引 物 ： 3 3 8 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）；PCR体系：10h Buffer 2 mL，dNTPs 2 μL，正反引物各0.8 μL，rTaq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2 μL，总计20 μL反应体系。PCR条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，29 个循环；72 ℃再 延伸10 min。
凝胶电泳： 1 % 琼脂糖凝胶， 核酸染料（Gengreen），电压90 V，电泳时间40 min。
1.3.4 高通量测序
采用Illumina高通量测序技术，基于Illumina MiSeq测序平台，分别对细菌V4高变区序列进行测序分析（由专业检测公司完成）。
1.3.5 理化指标的测定
水分测定采用135 ℃的烘干法；酸度测定采用酸碱滴定法；淀粉、还原糖检测采用斐林试剂法。具体参照DB 34/T 2264ü 2014《固态发酵酒醅分析方法》[17]。
1.3.6 机械化酿造工艺
本机械化酿造工艺流程与传统酿造工艺流程相同，主要是在酿造过程采用机械化代替人工操作，具体概述如下：应用润粮设备代替人工润粮，采取三段式润粮，控制每段的润粮时间、水分和温度；蒸粮蒸酒采用机械设备自动上甄，上甄下料采用垂直式下料、红外感应见汽下料，做到疏、松、匀、薄、轻、平等要求；摊凉、下曲、拌匀、运醅均为一体式机械设备，在线风冷摊凉、自动计量下曲、绞龙拌匀、传送带运醅，按工艺参数控制过程工艺参数，严格模拟传统酿造工艺要求；堆积采用垂直式、转盘设备下醅、堆积，地面堆积，参数控制按传统工艺执行；下窖、起窖采用传统酿造的行车、抱斗，工艺操作和控制严格执行传统工艺要求。
1.4 数据及图像处理
采用Microsoft Office Excel 2016进行数据计和分析。基于Illumina MiSeq测序平台，群落组成图、Heatmap图、冗余分析图利用R语言工具，物种相关性网络运用Cytoscape软件，丰度图利用Origin软件进行绘制。
2 结果与分析
2.1 细菌菌群结构多性

图 2 酒醅样品中的细菌群落结构（门水平）
Fig. 2 Bacterial community structure of fermented grain samples at phylum level
利用Illumina MiSeq平台测序得到品双端序列数据，再进行reads拼接以及对reads的质量和拼接效果进行质控过滤，共获得细菌的有效序列为339 310 条，通过USEARCH将标签分组成具有97%相似性的可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），将每个OTU与数据库进行比对，选取置信度阈值，即相似度在97%以上的序列进行物种分类，得到每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科、属分类水平。7 个轮次中共检测出14 个门，456 个属。对所检出的菌群结构进行分析如图2所示，各个轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中的共有优势菌门为Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes，该结果与黄蕴利等[11]研究酱香型白酒传统酿造的第2轮次发酵过程酒醅微生物多性所检出的优势菌门结论一致。戴亦杰等[18]研究发现，酱香型白酒大曲中的优势细菌门为Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes，且Firmicutes的相对丰度最高。而如图2所示，随着发酵轮次的变化，主导性的菌门由Firmicutes变为Proteobacteria，这说明第1轮次堆积发酵酒醅中的细菌主要来自于添加应用的酱香大曲，且与实际生产过程中酱香型白酒酿造的下沙和造沙加曲量生产相符合。

图 3 酒醅样品中的细菌群落结构（属水平）
Fig. 3 Bacterial community structure of fermented grain samples at genus level
如图3所示，在属水平上，不同轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中的细菌菌群在数量及结构分布上多性特征明显，但菌群的属类种别基本一致，1轮次共检测出130 个属，2轮次126 个属，3轮次129 个属，4轮次119 个属，5轮次125 个属，6轮次164 个属，7轮次136 个属。1轮次的菌属分布较均匀，相对丰度大于1%的有10 个属，包括Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Pediococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella，其中以前5 种为主（总相对丰度为84.74%）。从2轮次开始，Acinetobacter的相对丰度均大于50%，成为主导菌属。其中，2轮次的菌群多性有所降低，共6 个属的相对丰度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus和Thermoactinomyces。3、4、5轮次的产酒酒质最好，出酒率也高，被称为“大回酒”[19]，且4、5轮次香气特征较为相似，图3 表明其菌群结构也较相似。其中，3轮次有9 个属相对丰度大于1%，主要是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Sphingomonas和Thermoactinomyces。4轮次有9 个属相对丰度大于1%，以Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Rhodococcus、Sphingomonas和Thermoactinomyces为主。5轮次相对丰度大于1%的有8 个属，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。6、7轮次的菌群结构也相似，6轮次有9 个属相对丰度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Rhodococcus和Sphingomonas；7轮次共有8 个相对丰度大于1%的属，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。机械化酿造各个轮次堆积酒醅中的共有优势菌属主要为Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia，这些菌属在部分轮次中的相对丰度都在5%以上。上述结论表明，在酱香型白酒机械化酿造的各轮次之间参与堆积发酵并富集的微生物菌群结构多性特征非常明显，其各轮次的菌群结构共性特征显著性大于差异性，说明各轮次酿造的酿酒微生物稳定性较好，也表征了酱香型白酒酿造过程存在固有的特征性菌群结构。
2.2 核心微生物菌群及其功能
研究表明[20-22]，平均相对丰度大于1%且至少出现在一个品以上的菌属被定义为核心微生物属。本研究发现，机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌平均丰度大于1%且至少出现在1 个品以上的属有12 个，分别是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。如图4所示，该12 个菌属1～7轮次总相对丰度分别为97.98%、97.82%、97.20%、98.28%、97.52%、95.57%、95.51%，说明这12 个菌属一直稳定存在于酱香型白酒机械化酿造的堆积发酵过程，而且成为主导性菌群结构，可将其认为是机械化酿造堆积发酵过程的核心微生物结构菌群。其中，Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia在7 个轮次中的相对丰度均大于1%，且后4 种（Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia）为传统酿造酒醅中的优势菌群和功能菌群，对酒体酱香风味的形成具有重要贡献[23]。

图 4 酒醅样品中的核心细菌群落丰度图（属水平）
Fig. 4 Abundance of core bacterial community in fermented grain samples at genus level
A. 1、2轮次的核心细菌群落丰度图（外圈为1轮次）；B. 3、4、5轮次核心细菌群落丰度图（外圈为3轮次）；C. 6、7轮次核心细菌群落丰度图（外圈为6轮次）。
如图4所示，Acinetobacter在1～7轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中均为绝对优势菌属，但1轮次中的Acinetobacter含量较其余几个轮次少，而在4、5轮次发酵酒醅中的丰度含量最高，可能的原因是1轮次酿造正处于寒冬季节，环境温度较低，微生物生长较缓慢，而4、5轮次生产恰逢5、6月份，较高的环境温度与空气湿度为其提供了良好的生长条件。Acinetobacter主要来源于酿酒环境的空气[24]和生产用大曲[25]，是一种酿造环境优势细菌。该菌属也在传统酿造堆积发酵酒醅中检出，郭敏等[12]发现其在第7轮次发酵中的丰度较高（13.26%），在2、3轮次中其丰度则低于1%。该菌属成为机械化酿造堆积发酵中的绝对优势菌属，其可能源于机械搅拌增加了发酵酒醅的破碎率，再加上机械化堆积过程酒醅的堆料方式导致酒醅的紧密度过高，致使堆积酒醅间的氧容量降低，进而为Acinetobacter提供了良好的生长环境[26-27]，该菌属的多数菌在白酒酿造过程主要利用糖类物质产酸，改善发酵环境的酸度[28]。Bacillus在1～3轮次中丰度较高（图4），研究表明[4]其也是大曲中的优势菌群，是酱香白酒酱香风味物质形成的主要代谢贡献菌群，能产生蛋白酶与淀粉酶等水解酶类，其水解原料形成丰富的发酵前体物质，有利于风味物质的形成。Pediococcus、Lactobacillus与Weissella属于乳酸菌菌系，乳酸菌大多是兼性厌氧或厌氧菌[29]，在发酵过程具有重要的生物学结构调控功能[30]。在中国白酒酿造发酵体系中，乳酸菌主要代谢产乳酸，乳酸可与发酵体系中的其他代谢产物发生生化反应合成多种呈香、呈味物质，如乳酸乙酯等[31]。同时，乳酸菌还可促进发酵过程的美拉德反应，增加酒体中的呈香物质；乳酸菌代谢产生的各种有机酸还可维持酸性发酵环境，调控发酵体系中微生物结构间的平衡关系。乳酸杆菌也可利用霉菌等微生物代谢生成的朊、胨和多肽类物质形成氨基酸[32]，氨基酸进一步代谢产生酒体中的风味物质，对酱香风格的形成有重要贡献。Kroppenstedtia和Lentibacillus均被发现存在于大曲中，其在白酒生产中的具体作用尚不明确。Kroppenstedtia是1轮次中的优势菌属（图4），姚粟等[33]发现其也是高温大曲中细菌Firmicutes的第2优势菌属，且是一种嗜热菌属。Thermoactinomyces也是大曲中的优势菌属[33]，其在1～7轮次机械化酿造堆积发酵酒醅中的丰度含量随着轮次的增加而减少（图4），在5～7轮次中丰度低于1%，李豆南等[34]发现，该菌属可产生吡嗪和芳香类物质，对酱香型白酒的风味具有重要的作用。刘洋等[35]发现该菌属发酵代谢产碱性磷酸酶、酯酶、脂质酯酶和萘酚AS-BI磷酸水解酶，还具有糖化力、液化力和较高的蛋白质分解力，可降解酿酒原料中的淀粉、蛋白等生成香味物质。图4表明，Sphingomonas在机械化酿造堆积发酵过程随发酵轮次递增，丰度呈现一致的增加趋势。同时，该菌属能够降解芳香类化合物和产生多糖类物质[36]，还具有较强的产辅酶Q能力[29]，该菌属也存在于传统酿造堆积发酵的部分轮次中[37]。在机械化酿造中还检测到大量的Caulobacter，该菌属在1、2轮次中丰度含量较低，6、7轮次中含量最高，其在传统酿造堆积发酵酒醅中鲜见报道，是机械化酿造过程中的特有菌属，可能来源于机械设备和环境，在白酒发酵过程中的作用还有待进一步研究。Rhodococcus在整个群落结构中所占比例很小（图4），是一类可以从土壤等环境中分离获得的革兰氏阳性菌，属于Actinobacteria，可分泌大量的活性酶，能够充分利用有机化合物作为能源和碳源，对石油烃、有机腈和霉菌毒等具有降解 作用[38]，且具有降解白酒酿造废水的功能[39]。华苟 根等[40]等发现Rhodococcus属的fascians可降解柠檬苦，增加苦味果汁的香气。该菌属在传统酿造堆积发酵酒醅中鲜见报道，在白酒中的功能还有待进一步研究。上述结论表明，在机械化酿造堆积发酵过程其核心菌群结构相对性稳定程度高，对堆积发酵整体菌群结构的变化调控功能明显，这也是酱香型白酒酿造过程需要堆积发酵的必要，为下一步窖池发酵的微生物多性和稳定的菌群结构研究提供参考依据，实现高产和优质的前提条件。
2.3 核心微生物的相互作用

图 5 酒醅样品中的核心细菌群落相关性网络图（属水平）
Fig. 5 Network of core bacterial community in fermented grain samples at genus level
A.核心细菌群落的相关性网络图；B.核心细菌群落正相关调控的相互作用；C.核心细菌群落负相关调控的网络图；D.核心细菌群落中负相关调控的细菌间的相互作用。不同颜色圆球表示不同门，蓝色为Actinobacteria，紫色为Proteobacteria，橙色为Firmicutes；连线的颜色表示正负相关性，红色表示正相关，紫色表示极显著正相关，绿色表示负相关，蓝色表示极显著负相关。
为深入挖掘特定环境中复杂微生物群落物种之间相关性，系统认识核心微生物菌群之间的相互关系及其调控机制，将12 个核心细菌属进行物种相关性网络分析。如图5A所示，12 个核心细菌属之间具有极其复杂的相互生物学作用，这些复杂的共生关系和拮抗关系形成了稳定的微生物群落结构，这也是发酵过程微生物菌群稳定性和演替的内在调控动力和机制。Bacillus、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Pediococcus和Oceanobacillus属于Firmicutes，它们之间绝大部分呈现共生关系 （图5B）。其中，Bacillus与Thermoactinomyces极显著正相关（P＜0.01）；Kroppenstedtia与Lentibacillus极显著正相关（P＜0.01）。Pediococcus与Thermoactinomyces显著正相关（P＜0.05）。Weissella与Thermoactinomyces、Lentibacillus显著正相关（P＜0.05）。Acinetobacter、Caulobacter和Sphingomonas属于Proteobacteria，Rhodococcu属于Actinobacteria，从图5C可知，该3 个菌属和其他9 个基本都呈现负相关。其中，Acinetobacter与Kroppenstedtia显著负相关（P＜0.05）；Caulobacter与Thermoactinomyces和Weissella显著负相关（P＜0.05）；Thermoactinomyces与Sphingomonas和Pediococcus极显著负相关（P＜0.01），与Bacillus显著负相关 （P＜0.05）；Rhodococcus与Weissella极显著负相关 （P＜0.01）。Caulobacter与Rhodococcus和Sphingomonas极显著正相关（P＜0.01）。从核心菌属之间的相关性结果表明，在堆积发酵的菌群多性复杂体系中，正是因为核心菌群之间形成的共生、拮抗等生物学关系，才构成了复杂体系中的协同共生关系，维持整个发酵体系的正常、稳态发展，推进酿造进程沿袭乙醇发酵和风味富集方向发展。
2.4 环境因子对核心细菌菌群结构的影响

图 6 环境因子对核心细菌群落的影响
Fig. 6 Effects of environmental factors on core bacterial communities
绿色箭头表示物种；红色箭头表示数量型环境因子，环境因子箭头的长短可以代表环境因子对于物种数据的影响程度（解释量）的大小；环境因子箭头间的夹代表正、负相关性（锐：正相关；钝：负相关；直：无相关性）；从品点向数量型环境因子的箭头作投影，投影点距离原点的距离代表环境因子对本群落分布相对影响的大小。
环境因影响微生物的生命活动，进而调控微生物在发酵过程的演替，为揭示环境因子对核心细菌群落的影响，将12 个核心菌属进行环境的关联分析。如 图6所示，水分、酸度、还原糖、淀粉含量对微生物群落结构有重要的影响，其中淀粉含量与其他3 个环境因子负相关（环境因子箭头间的夹为钝），而水分、酸度和还原糖含量正相关（环境因子箭头间的夹为锐），且微生物受淀粉含量、水分和酸度的影响较大。其中，1、2轮次的微生物菌群结构受淀粉含量影响较大（淀粉分别为33.71%和31.12%），呈正相关，而 6、7轮次在淀粉含量向量的相反方向（淀粉分别为13.6%和12.21%），呈负相关。这主要是因为1、2轮次发酵过程，酒醅中的微生物主要来源于大曲且含量较少，需要分解淀粉进一步增殖，因而与淀粉含量正相关，而6、7轮次，发酵酒醅中的淀粉已经消耗殆尽（13.6%和12.21%），发酵进入尾声，没有更多的发酵底物供给微生物生长。1、2轮次发酵的微生物结构与水分负相关（水分分别为43.58%和46.84%），而3～7轮次与水分正相关（由49.55%上升到55.87%）。生产实践表明， 1、2轮次发酵过程，环境温度较低，空气中的湿度已经满足微生物的生长需求，而3轮次开始，气温较高，微生物生长需要水分。1、2轮次发酵过程微生物菌群结构与酸度呈负相关（分别为0.4 mmol/10 g和1.92 mmol/10 g），而3～7轮次与酸度呈正相关（分别为2.51、3.32、4.63、3.98 mmol/10 g和3.81 mmol/10 g）；其中，5、6 轮次发酵受酸度影响较大（分别为4.6 mmol/10 g和3.98 mmol/10 g），这与生产实际也相吻合。还原糖对于微生物的结构的影响较小。

图 7 核心细菌群落与环境因子的相关性Heatmap
Fig. 7 Heatmap for the correlation between core bacterial communities and environmental factors
*.显著相关，P＜0.05；**.极显著相关， P＜0.01；***.高度显著相关，P＜0.001。
核心微生物受环境因子影响也较大，如图7 所示，Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus和Weissella均与淀粉含量显著正相关（R分别为0.929、1、0.786、0.786），且Bacillus与淀粉含量极显著正相关 （P＜0.01），Thermoactinomyces与淀粉含量高度显著正相关（P＜0.001）。这主要因为Bacillus能产生蛋白酶与淀粉酶等水解酶类，水解原料形成丰富的发酵前体物质[4]，而Thermoactinomyces具有糖化力、液化力和较高的蛋白质分解力，可降解酿酒原料中的淀粉、蛋白等生成香味物质[34]。Caulobacter与淀粉含量显著负相关（P＜0.05，R=0.821）、Sphingomonas与淀粉含量极显著负相关（P＜0.01，R=0.929），因为Sphingomonas降解芳香类化合物；Caulobacter可能来源于机械设备或环境。还原糖含量对核心微生物没有影响。Caulobacter和Sphingomonas与水分显著正相关（R分别为0.857、0.964），其中Sphingomonas高度正相关 （P＜0.001），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与水分显著负相关（R分别为0.857、 0.964、0.893），且Thermoactinomyces和Pediococcus极显著和高度负相关（P ＜0.0 1，P ＜0.0 0 1）。Sphingomonas与酸度显著正相关（P＜0.05，R=0.857），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与酸度显著负相关（R分别为0.857、0.857、0.929），且Pediococcus极显著负相关（P＜0.01），这说明酸度高、水分大会抑制大部分微生物的生长，不利于发酵的进行，因在生产上要控制Sphingomonas的生长。上述结果表明，在机械化酿造堆积发酵过程，环境因子水分、淀粉含量和酸度与核心细菌菌群中的菌属之间具有密切的相关性，表明堆积发酵过程水分、淀粉含量和酸度对微生物生长具有紧密的调控作用，共同形成推动发酵过程的微生物菌群结构，促进酿造发酵的正常进行。
3 结 论
本研究利用高通量测序及数理分析方法系统性研究酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌菌群结构特征，7 个轮次中共检测出14 个门，456 个属，优势菌门为Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes；在属水平上，不同轮次堆积发酵酒醅中的细菌菌群在数量及结构分布上多性特征明显，且主要核心菌群种类基本一致。根据各菌群丰度将12 种菌群定义为酱香白酒机械化酿造的核心细菌属，分别是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。核心微生物菌群之间的物种相关性网络分析结果表明，Bacillus、Lactobacillus和Sphingomonas在酱香型白酒机械化酿造各轮次发酵过程堆积发酵核心微生物菌群中具有重要的生物学调控作用；Caulobacter与大部分核心微生物存在拮抗作用，Oceanobacillus与大部分核心菌属属于共生关系。堆积发酵过程的环境因子中，水分、酸度、淀粉含量对微生物群落结构影响较大，产生了重要的调控作用，其中Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus与淀粉含量显著正相关，与水分、酸度显著负相关；Caulobacter、Sphingomonas与淀粉含量显著负相关，与水分含量显著正相关，Sphingomonas还与酒醅酸度显著正相关。本研究为推进酱香型白酒机械化酿造发展提供了基础理论和学科依据。
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Bacterial Community Structure and Diversity in Different Stacking Fermentation Rounds in Mechanized Maotai-Flavor Liquor Brewing
WANG Huan1, XI Dezhou2, HUANG Yongguang1,*, CAO Wentao1, YOU Xiaolong2, CHENG Pingyan2, HU Feng2
(1. Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province, School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Guizhou Moutai Brewry (Group) Xijiu Co. Ltd., Xishui 564622, China)
Abstract: In this study, the 16S rDNA fragments of bacteria in fermented grains from seven rounds of stacking fermentation in Maotai-flavor liquor mechanized brewing were sequenced and analyzed by high-throughput sequencing technology. The results showed that a total of 14 phyla and 456 genera were detected in the seven rounds. Proteobacteria, Actinobacteria, and Firmicutes were the dominant phyla. The core bacteria were Acinetobacter, Bacillus, Caulobacter, Kroppenstedtia, Lactobacillus, Lentibacillus, Oceanobacillus, Pediococcus, Rhodococcus, Sphingomonas, Thermoactinomyces and Weissella. Both Caulobacter and Rhodococcus were the unique genera of bacteria in the process of mechanized brewing, which may come from the mechanical equipment or environment. The core microorganisms were interrelated to each other, including the symbiotic bacteria Bacillus, Lactobacillus, Thermoactinomyces, Lentibacillus, Kroppenstedtia, Weissella, Pediococcus and Oceanobacillus, while Acinetobacter, Caulobacter and Philingomonas were negatively correlated with the other nine genera. Among the fermentation environmental factors, moisture, acidity and starch content had great influence on the microbial community structure. Bacillus, Thermoactinomyces and Pediococcus were positively correlated with starch content and negatively correlated with moisture and acidity. Caulobacter and Sphingomonas were negatively correlated with starch content and positively correlated with moisture, and Sphingomonas was also positively correlated with acidity. The core bacterial community in the process of mechanized fermentation of Maotai-flavor liquor revealed in this study lays a scientific foundation for further theoretical research and engineering application of mechanized fermentation of Maotaiflavor liquor.
Keywords: Maotai-flavor liquor; mechanization; high-throughput sequencing; microbial community and structure; stacking fermentation; core bacterial community
收稿日期：2018-12-18
基金项目：贵州省重点基金项目（黔科合基础[2017]1405）；贵州省科技平台及人才团队计划项目（黔科合平台人才[2016]5637）；贵州省科学技术厅重大专项（黔科合重大专项字[2015]6012）
第一作者简介：王欢（1995ü ）（ORCID: 0000-0002-5934-3775），女，硕士研究生，研究方向为白酒微生物多性和微生物组。E-mail: 563006960@qq.com
*通信作者简介：黄永光（1976ü ）（ORCID: 0000-0002-6170-7718），男，研究员，博士，研究方向为酿酒微生物、酿酒工艺及酒体品质。E-mail: 772566120@qq.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181218-202
中文分类号：TS261.1；TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）02-0188-08
引文格式：王欢, 席德州, 黄永光, 等. 酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵细菌菌群结构多性分析[J]. 食品科学, 2020, 41(2): 188-195. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181218-202. http://www.spkx.net.cn
WANG Huan, XI Dezhou, HUANG Yongguang, et al. Bacterial community structure and diversity in different stacking fermentation rounds in mechanized Maotai-flavor liquor brewing[J]. Food Science, 2020, 41(2): 188-195. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181218-202. http://www.spkx.net.cn