葡萄籽原花青素对高脂高糖饮食诱导代谢 综合征大鼠干预...

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葡萄籽原花青素对高脂高糖饮食诱导代谢 综合征大鼠干预作用
张艳华，汪 雄，王文利，张 雷，车会莲，张雅丽*
（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）
摘 要：本研究通过高糖高脂饮食（high-fat and high-sugar diet，HSHF）建立SD大鼠代谢综合征模型，旨在探究葡萄籽原花青素对代谢综合征大鼠的体质量、血糖浓度、胰岛素敏感性、血清脂质水平和炎症的干预作用。结果表明，与正常对照组相比，24 周后，喂食HSHF的大鼠出现腹部肥胖、葡萄糖耐量降低、动脉粥样硬化性血脂紊乱、肝脏脂肪沉积。葡萄籽原花青素（20、40、80 mg/kg mb）干预大鼠8 周后，空腹血糖、血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、炎症因子白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α水平均显著降低，高密度脂蛋白胆固醇水平显著升高。苏木精-伊红切片分析结果表明，葡萄籽原花青素能够减小脂肪组织细胞脂滴面积，减轻了肝脏脂肪沉积。葡萄籽原花青素降低代谢综合征大鼠的体质量，改善大鼠血糖和脂代谢紊乱，以及降低血清炎症因子水平，因此有望作为潜在的调节代谢综合征的天然活性产物。
关键词：葡萄籽原花青素；肥胖；代谢综合征；降血脂
代谢综合征是以肥胖（中心性肥胖）或胰岛素抵抗（高胰岛素血症、葡萄糖耐量受损）为核心，合并血脂异常（甘油三酯（triglyceride，TG）升高、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）降低）及高血压的一组复杂的代谢紊乱症候群[1]。代谢综合征提高心血管疾病和2型糖尿病致病风险[2]，致死率增加近1.6 倍[3]。据统计，全球代谢综合征患病人数约在25%以上[4]。基于这些现状，探讨代谢综合征的干预策略有助于更好地改善代谢综合征患病现状。普遍认为，体育锻炼和低热量饮食结合是预防和治疗代谢综合征的最佳方法[5]。代谢综合征机理背景复杂，导致研发有效预防或改善代谢综合征的药物变得非常困难，目前市面上常见药物是以代谢综合征单一组分为目标进行干预。但药物治疗的缺点在于靶点单一，容易引起副作用[6]。从食物中寻找有效干预代谢综合征的天然产物已然成为新趋势。
原花青素是黄烷-3-醇或黄烷醇单体的低聚或聚合形式，其单体主要是儿茶素和表儿茶素，原花青素广泛存在于许多植物的树皮、叶子、果实及种子中，是坚果、香料、水果和葡萄酒中发现的主要黄酮类化合物之一[7]。 近年来研究表明，原花青素对代谢综合征症状具有积极的干预作用，显示出改善大鼠脂肪堆积、血脂水平异常、胰岛素抵抗的有益特性，其中葡萄籽原花青素更甚。Gil-Cardoso等报道了3 周低剂量葡萄籽原花青素（5、25、50 mg/kg）干预对肥胖模型大鼠的体质量增长、脂肪系数没有显著影响[8]；另有报道指出葡萄籽原花青素（25 mg/kg）干预10 d[9]和3 周[10]虽不能降低肥胖大鼠体质量和脂肪系数，但可以降低血清总胆固醇（total cholesterol，TC）水平，改善血脂紊乱；Montagut等报道了葡萄籽原花青素（25、50 mg/kg mb）对肥胖和胰岛素抵抗模型大鼠的干预作用，发现4 周葡萄籽原花青素摄入未改变大鼠体质量、内脏脂肪指标，但改善了大鼠胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）[11]；这些报道大部分仅描述单一的肥胖、高血脂或胰岛素抵抗模型，除此之外，葡萄籽原花青素干预时间大多集中在3～4 周，最短的仅有10 d；基于上述综述，认为葡萄籽原花青素对代谢综合征整体评价作用的数据是有限的，因此，本实验通过建立代谢综合征大鼠模型，综合性模拟人类代谢综合征发现的肥胖、血脂紊乱、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性等症状，从体质量、脏器指标、血浆指标、口服葡萄糖耐量、脂肪吸收、组织切片等多个方面系统地阐述长期（8 周）葡萄籽原花青素干预对代谢综合征大鼠生理指标的影响，以期为葡萄籽原花青素对代谢综合征的干预作用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
180～200 g SPF级雄性SD大鼠，购于北京为维通利华实验动物技术限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养于SPF级动物房。实验大鼠同室分笼，每笼5 只，室温控制在（22f 2）℃，相对湿度40%～70%，严格遵循12 h人工照明/黑暗循环，换气次数15 次/h。
葡萄籽原花青素（纯度＞95%） 北京索莱宝科技有限公司；TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、HDL-C、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、游离脂肪酸、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、胰岛素、葡萄糖、瘦素、脂联素试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司；基础饲料（standard chow diet，Chow）、高脂高糖饲料（high-fat and high-sugar diet，HFHS） 华阜康生物有限公司。
基础饲料组成为：玉米、豆粕、小麦麸、小麦次粉、鱼粉、大豆油、石粉、磷酸氢钙、盐、氯化胆碱、赖氨酸、多种维生素、多种矿物元素。基础饲料（碳水化合物55.9%（质量分数，后同）、粗蛋白19.2%、粗脂肪4.6%）总热能14.32 kJ/g；高脂高糖饲料组成为：15%猪油、15%蔗糖、70%基础饲料。高脂高糖饲料（碳水化合物54.1%、粗蛋白13.4%、粗脂肪18.2%）总热能19.34 kJ/g。
1.2 仪器与设备
全自动生化仪 深圳迈瑞医疗电子股份有限公司； 酶标分析仪 无锡华卫德朗仪器有限公司；血糖仪 雅培糖尿病护理有限公司；全封闭组织脱水机 樱花 医疗科技（泰州）有限公司；KD-BM包埋机冷冻台 金华市科迪仪器设备有限公司；石蜡切片机、正置荧光显微镜 德国Leica公司；Prima YB12恒温水浴锅 戈普仪器（上海）有限公司；UB100i普通显微镜 重庆澳浦光电技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 诱导肥胖大鼠模型
大鼠随机分为基础饲料对照组（Chow组，n＝6）和高脂高糖饲料组（HFHS组，n＝24）。给大鼠提供充足饲料和正常饮水。每周记录大鼠体质量变化，16 周后HFHS组大鼠平均体质量超过Chow组20%即视为饮食诱导肥胖大鼠。
1.3.2 实验分组与给药
以健康大鼠为正常组（Chow组：基础饲料＋0.5% CMC-Na混悬液），肥胖模型大鼠随机分为高糖高脂饲料对照组（HFHS组，高糖高脂饲料＋0.5% CMC-Na混悬液）、原花青素低剂量组（GSPE-L组，高糖高脂饲料＋20 mg/kg mb GSPE）、原花青素中剂量组（GSPE-M组，高糖高脂饲料＋40 mg/kg mb GSPE）、原花青素高剂量组（GSPE-H组，高糖高脂饲料＋80 mg/kg mb GSPE）。
GSPE混悬于0.5% CMC-Na溶液灌胃，Chow组和HFHS组大鼠灌胃0.5% CMC-Na溶液。各组大鼠每日灌胃给药1 次，连续8 周。Chow组大鼠喂食基础饲料，其余组大鼠继续喂食高脂高糖饲料。观察记录给药后大鼠每周体质量、进食量变化。实验期间，大鼠自由饮水进食。
1.3.3 实验大鼠组织取材
给药干预8 周后，大鼠于前一天晚18点开始禁食，禁食期间，保持正常饮水。实验当天，腹腔注射6%水合氯醛腹腔至大鼠麻醉，眼球采血并收集于采血管中；血液经3 000 r/min离心15 min后，取上层血清于－80 ℃保存。采血后断头处死，并取大鼠完整肝脏、心脏、肾脏、胰腺、空肠、腓肠肌、胫骨前肌、附睾脂肪组织（epididymal white adipose tissue，eWAT）、肾周脂肪组织（perirenal white adipose tissue，pWAT）、腹股沟皮下脂肪组织（inguinal subcutaneous white adipose tissue，iWAT）、肩胛骨棕色脂肪组织（scapula brown adipose tissue，sBAT），用滤纸吸干组织液后并称质量。称质量后取部分脏器（组织），完全浸泡于福尔马林溶液中固定，以待进行石蜡切片。脏器（组织）系数按式（1）计算。

式中：m0为脏器（组织）质量/g；m为大鼠体质量/g。
1.3.4 口服糖耐量测定
给药干预第8周，对实验大鼠进行口服葡萄糖耐受实验（oral glucose tolerance test，OGTT）。大鼠于实验前一天18点开始禁食，禁食12～18 h。禁食期间，保持正常饮水。实验当天，眼球取血，按照试剂盒方法测定空腹血浆胰岛素（fasting plasma insulin，FPI）含量；尾尖取血，用血糖仪测定空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）水平后，对空腹大鼠经口灌胃2 g/kg葡萄糖，分别测定30（0.5hPG）、60（1hPG）、120 min（2hPG）大鼠血糖水平，绘制糖耐量曲线。分别按照式（2）～（4）分别计算血糖曲线下面积（area under curve，AUC）、HOMA-IR、胰岛素敏感指数（homeostasis model assessment of insulin sensitive index，HOMA-ISI）。

1.3.5 血清生化指标测定
TC、TG、HDL-C、LDL-C、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）、极低密度脂蛋白胆固醇（very low density lipoprotein chesterol，VLDL-C）、ALT、AST、IL-6、TNF-α、瘦素、脂联素按照试剂盒说明书测定。
1.3.6 脏器组织切片观察
肝脏、肾脏、胰腺、腓肠肌、空肠、附睾脂肪、腹股沟皮下脂肪、肩胛骨棕色脂肪按照固定→脱水→ 浸蜡→包埋→切片→脱蜡→复水→染色→烘干→封片→观察步骤进行制片，制片完成后，在光学显微镜200 倍下观察载玻片，每个组织随机选择3 个视野进行拍照，最后用Image-Pro软件计算脂肪细胞直径。
1.3.7 粪便脂肪含量测定
参考周中凯等[12]的方法，实验干预第8周时，收集大鼠粪便，冷冻干燥成粉末后，于－80 ℃冰箱保存。准确称取0.1 g粪便样品，加入0.4 mL蒸馏水，混匀后加入1 mL蒸馏水，混匀后加入0.6 mL浓盐酸，放到80 ℃水浴锅50 min，冷却后加入乙醚3 mL加塞反复倒转2～3 min（约60～80 次），使其彻底混合。静置15 min后吸取上清液于已恒质量的蒸发皿内，置于烘箱中105 ℃干燥至恒质量，在分析天平上准确称取质量。粪便脂肪含量按 式（5）计算。

式中：m1为脂肪及蒸发皿质量/g；m2为蒸发皿 质量/g；m为样品粪便质量/g。
1.4 数据统计分析
数据结果以平均值±标准差表示，使用GraphPad Prism 8.0软件作图，采用SPSS进行单因素方差分析， P＜0.05认为存在显著性差异。
2 结果与分析
2.1 GSPE对HFHS大鼠体质量的影响
肥胖是代谢综合征最明显的特征，而体质量指标是检验肥胖的最直接体现。在造模初期，各组大鼠初始平均体质量无明显差异。如图1所示，16 周后，高脂饲料喂养大鼠（即HFHS组与各干预组）体质量显著高于基础饲料对照组（Chow组），并超过基础饲料组体质量20%。表明肥胖模型造模成功。对实验组大鼠为期8 周的GSPE干预有效抑制了HFHS诱导的体质量增长。GSPE高剂量组体质量在干预第2周即显示出下降趋势，第8周体质量显著低于HFHS组。GSPE低剂量和中剂量组体质量相较于HFHS组也有一定下降趋势，但截至第8周，并未表现出显著性差异。GSPE干预组在干预期内体质量增量显著低于HFHS组，并且呈现剂量依赖性，表明GSPE可以有效抑制HFHS大鼠体质量增长。为了检验GSPE导致HFHS大鼠体质量增量降低与食欲之间的关系，本实验对各组大鼠的食物摄入量进行了定期追踪（图2），结果显示GSPE干预对HFHS大鼠日均摄食量以及日均摄食总能均无影响。表明葡萄籽原花青素在不影响大鼠能量摄入的条件下降低大鼠体质量增量。

图 1 葡萄籽原花青素对大鼠体质量及体质量增量的影响（n＝ 6）
Fig. 1 Effect of GSPE on body mass and body mass gain of rats (n = 6)

图 2 葡萄籽原花青素对大鼠食物及能量摄入的影响（n＝ 6）
Fig. 2 Effect of GSPE on food and energy intake of rats (n = 6)
2.2 GSPE对HFHS大鼠脂肪组织扩增的影响
肥胖主要是白色脂肪组织的扩增，HFHS显著增加大鼠腹股沟皮下脂肪、附睾脂肪和肾周脂肪质量系数。由表1可知，GSPE干预以剂量依赖性降低大鼠腹股沟皮下脂肪系数，但未造成显著差异。GSPE低剂量组显著降低HFHS大鼠附睾脂肪系数，GSPE中剂量和高剂量组未对附睾脂肪系数造成影响。3 组GSPE干预均显著降低大鼠肾周脂肪系数。由图3～5可知，HFHS诱导大鼠腹股沟皮下脂肪细胞以及附睾脂肪细胞面积增加，GSPE干预使得白色脂肪细胞面积显著减小，相同显微镜视野下脂肪细胞数量明显增多。表明GSPE可以抑制白色脂肪细胞脂质堆积。
棕色脂肪是一种消耗能量的脂肪组织，其细胞较小，周围包绕着许多小脂滴，细胞间含有丰富的线粒体和毛细血管使得细胞呈现棕色。棕色脂肪组织通过线粒体解偶联蛋白作用消耗脂肪，使能量直接以热量形式丧失而不生成ATP。因此，棕色脂肪细胞数量以及线粒体含量是棕色脂肪组织发挥产热功能的基础。如图6所示，HFHS诱导大鼠棕色脂肪细胞内脂滴面积显著增大，GSPE干预以剂量依赖性逆转这一状况，减小棕色脂肪细胞脂滴面积。表明GSPE干预可能刺激棕色脂肪组织生热作用。
表 1 葡萄籽原花青素对大鼠脏器（组织）系数的影响（n＝6）
Table 1 Effect of GSPE on organ or tissue coefficients of rats (n = 6)

注：同行肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

图 3 葡萄籽原花青素对大鼠iWAT形态的影响（×100）
Fig. 3 Effect of GSPE on inguinal subcutaneous white adipose tissue of rats (× 100)

图 4 葡萄籽原花青素对大鼠附睾脂肪组织形态的影响（×100）
Fig. 4 Effect of GSPE on epididymal white adipose tissue tissue of rats (× 100)

图 5 葡萄籽原花青素对大鼠白色脂肪组织细胞面积的影响（n＝ 6）
Fig. 5 Effect of GSPE on white adipocyte area of rats (n = 6)


图 6 葡萄籽原花青素对大鼠sBAT形态的影响（×100）
Fig. 6 Effect of GSPE on scapula brown adipose tissue of rats (× 100)
2.3 GSPE对HFHS大鼠肝脏脂肪沉积的影响

图 7 葡萄籽原花青素对各组大鼠肝脏形态的影响
Fig. 7 Effect of GSPE on liver morphology of rats

图 8 葡萄籽原花青素对大鼠肝脏组织形态的影响（×200）
Fig. 8 Effect of GSPE on liver tissue of rats (× 200)
比较各组大鼠肝脏形态发现（图7），Chow组大鼠肝脏颜色呈深紫红色，表面光滑柔软，边缘尖锐，按压富有弹性；HFHS组大鼠肝脏呈米黄色，表面呈明显的弥漫性肿大，边缘明显增厚且变钝，压迫时无弹性甚至出现凹陷，呈现出明显的脂肪肝。GSPE低剂量和中剂量组干预组肝脏颜色呈褐色，出现局部泛白与肿胀，高剂量组大鼠肝脏呈现深紫红色，呈健康状态。由图8可知，Chow组大鼠肝细胞排列整齐、结构清晰，在中央静脉周围成放射状分布，HFHS组大鼠肝细胞排列紊乱，胞浆内出现大量大面积脂肪空泡。GSPE低剂量干预组大鼠脂肪空泡较HFHS小且少，GSPE中剂量组和高剂量组未见明显脂肪空泡。结果表明GSPE干预可以逆转大鼠脂肪变性状态，改善高脂膳食小鼠肝脏脂质累积。
2.4 GSPE对HFHS大鼠肝脏功能的影响

图 9 葡萄籽原花青素对大鼠肝功能指标的影响（n＝ 6）
Fig. 9 Effect of GSPE on liver function indexes of rats (n = 6)
从图9可以看出，与Chow组相比，HFHS组大鼠AST、ALT活力显著提高，表明HFHS喂养大鼠会导致肝脏功能受损。GSPE干预8 周后，大鼠血清AST、ALT活力以剂量依赖性降低，实验结果表明GSPE干预会剂量依赖性逆转高脂高糖大鼠导致的肝功能损伤。
2.5 GSPE对HFHS大鼠脂代谢的影响
血液中的脂质水平是机体脂代谢是否正常的重要判断标准。由图10可知，HFHS组大鼠与Chow组相比，TC、TG、LDL-C、FFA水平均显著升高，表明HFHS诱导大鼠血脂紊乱。相比HFHS组，3 组GSPE干预组的TC水平有所下降，但未表现出统计学差异。GSPE干预显著降低大鼠血浆TG和FFA水平。GSPE高剂量组表现出显著降低血浆LDL-C水平的效果。相比Chow组，HFHS组大鼠HDL-C水平并未发生变化，但GSPE低剂量组可显著增加大鼠HDL-C水平。HFHS组大鼠VLDL-C水平显著降低，GSPE低剂量干预可显著增加大鼠VLDL-C水平。实验结果表明，葡萄籽原花青素通过下调血浆游离脂肪酸和甘油三酯水平改善高脂高糖饮食诱导的血脂紊乱。
为了进一步探究葡萄籽原花青素调节血脂紊乱的机制，本实验测定了各组大鼠粪便总脂肪含量，以及脂肪表观消化率。由图11可知，GSPE中、高剂量干预组显著增加HFHS大鼠粪便脂肪含量，降低脂肪表观消化率。GSPE低剂量组未表现出降低大鼠脂肪消化吸收的效果。表明高浓度GSPE在肠道中抑制膳食粗脂肪的消化吸收。

图 10 葡萄籽原花青素对大鼠血脂水平的影响（n＝6）
Fig. 10 Effect of GSPE on blood lipid levels of rats (n = 6)

图 11 葡萄籽原花青素对大鼠脂肪消化吸收的影响（n＝ 6）
Fig. 11 Effect of GSPE on fat digestion and absorption of rats (n = 6)
2.6 GSPE对HFHS大鼠糖耐量和胰岛素抵抗的影响


图 12 葡萄籽原花青素对大鼠糖耐量和胰岛素抵抗的影响（n＝ 6）
Fig. 12 Effect of GSPE on glucose tolerance and insulin resistance of rats (n = 6)
PIP干预第7周对大鼠进行OGTT实验。如图12所示，HFHS组大鼠的空腹血糖水平与Chow组相比无变化，但口服2 g/kg葡萄糖后2 h血糖浓度显著升高，血糖曲线面积明显增大，表明HFHS诱导大鼠出现葡萄糖稳态失调现象。HFHS组大鼠血清胰岛素含量升高，HOMA-IR升高，HOMA-ISI下降，表明HFHS诱导大鼠出现胰岛素抵抗，胰岛素敏感性降低。GSPE干预显著降低空腹血糖水平以及血糖曲线下面积。表明GSPE可以改善HFHS诱导产生的葡萄糖不耐受性。GSPE干预组血清胰岛素水平相比HFHS组呈剂量依赖性降低，同时GSPE干预可以显著逆转HFHS诱导的HOMA-IR和HOMA-ISI的变化趋势，降低大鼠HOMA-IR水平，增加HOMA-ISI水平，且该效果存在剂量依赖性。实验结果表明GSPE可以有效降低肥胖大鼠的葡萄糖与胰岛素水平，改善葡萄糖耐量与胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性。
2.7 GSPE对HFHS大鼠脂肪细胞因子的影响

图 13 葡萄籽原花青素对大鼠血浆脂肪细胞因子水平的影响（n＝ 6）
Fig. 13 Effect of GSPE on blood adipocytokine levels of rats (n = 6)
瘦素和脂联素是脂肪细胞分泌的激素，与肥胖和代谢综合征密切相关。本实验检测了血清中瘦素和脂联素含量。从图13可以看出，HFHS组大鼠血清脂联素水平显著降低，GSPE干预使脂联素水平剂量依赖性提高，高剂量组与HFHS组相比具有显著差异性。相比Chow组，HFHS导致瘦素水平显著增加，而GSPE干预使瘦素水平剂量依赖性下降，GSPE高剂量组与HFHS组相比具有显著性差异。实验结果表明GSPE干预以剂量依赖性方式增加高脂高糖饮食大鼠脂联素水平，降低瘦素水平。
2.8 GSPE对HFHS大鼠炎症水平的影响

图 14 葡萄籽原花青素对大鼠炎症指标的影响（n=6）
Fig. 14 Effect of GSPE on inflammatory biomarkers of rats (n = 6)
炎症与慢性综合征息息相关，本实验检测了血清炎症指标含量。如图14所示，相比Chow组，HFHS喂养大鼠血清IL-6、TNF-α水平显著提高，提示长期高脂饮食会导致慢性炎症。8 周GSPE干预会减轻炎症症状，降低IL-6和TNF-α水平，并且呈现出剂量依赖性。
3 讨 论
葡萄籽原花青素作为红酒及葡萄的主要黄酮类活性成分，是人类饮食的重要部分。在本实验中，按照人均每日消费100 mL红酒换算成为大鼠等效剂量[13]得出本实验葡萄籽原花青素低剂量20 mg/kg，同时设置了2 倍（40 mg/kg）中剂量组和4 倍（80 mg/kg）高剂量组以观察不同剂量葡萄籽原花青素对代谢综合征大鼠的干预作用。
诱导代谢综合征模型方法包括饮食诱导、遗传修饰和药物诱导等，此前有报道认为高碳水化合物高脂肪饮食诱导的大鼠模型最接近人类MetS标准[14]。本实验用高糖高脂肪饲料（15%蔗糖、15%猪油）诱导SD大鼠代谢综合征模型，模拟人类代谢综合征发现的肥胖，血脂紊乱，葡萄糖耐受不良，胰岛素抵抗，肝损伤等症状。高糖高脂饲喂24 周后，大鼠体质量增加17%，葡萄糖负荷后2 h内血糖浓度不能恢复正常，血糖曲线面积升高，血清TC、TG、LDL-C水平升高，并且出现高胰岛素血症，这些证据表明代谢综合征模型建立成功，并且后8 周的葡萄籽原花青素干预减弱或逆转这些代谢紊乱反应。
肥胖是代谢综合征核心特征之一，研究结果显示8 周葡萄籽原花青素干预显著降低大鼠体质量增长幅度与体内脂肪堆积，减少白色脂肪细胞面积，并且这一效果不是建立在影响食欲和能量摄入的基础上实现的。先前有报道表明，原花青素可通过抵消肥胖大鼠瘦素抵抗，调控食欲相关基因[15]以及肠道激素[16]，进而抑制食欲。但本实验剂量范围内，葡萄籽原花青素并未表现出影响大鼠食欲的效果。这可能与原花青素组成、干预方式以及测量方法有关。
葡萄籽原花青素改善动脉粥样硬化性血脂紊乱。本实验中8 周葡萄籽原花青素干预显著降低血清甘油三酯和游离脂肪酸水平；高剂量葡萄籽原花青素显示出下调LDL作用，低剂量葡萄籽原花青素显著升高血浆HDL水平，表明葡萄籽原花青素降低动脉粥样硬化风险。其降血脂机制之一可能是原花青素靶向肠道致使脂肪消化吸收减少，本实验结果表明中、高剂量葡萄籽原花青素均降低脂肪表观消化率。之前有报道指出原花青素和富含原花青素的食物可以抑制胰脂肪酶活性、降低乳糜微粒分泌[17]，肠道菌群也有可能成为原花青素抑制脂肪吸收的靶点。血脂水平降低可能原因除外源性脂肪吸收降低外，也可能是内源性脂肪生成减少，脂肪代谢增加。肝脏是脂质代谢主要器官，已经有报道指出，葡萄籽原花青素可以抑制肝脏胆固醇、TG和VLDL相关合成酶的基因表达，增加肝脏脂肪酸氧化相关酶基因表达[9,18]。
葡萄籽原花青素改善HFHS诱导的葡萄糖稳态失调，限制口服葡萄糖导致的餐后血糖浓度升高，同时降低血浆胰岛素含量和胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性。尽管HFHS并未诱导大鼠出现高血糖症状，但8 周葡萄籽原花青素的干预仍降低大鼠空腹血糖浓度。其降血糖的机制可能直接靶向肠道葡萄糖吸收，肠道是葡萄糖的第一代谢部位。事实上，不少体外研究显示源自不同植物来源的原花青素可以抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性[21]。一些单体黄烷-3-醇还通过抑制参与葡萄糖摄取到肠道的转运蛋白来抑制葡萄糖吸收[22]。肝脏也在维持葡萄糖稳态中起着重要作用。原花青素可以通过调节肝细胞的功能来影响葡萄糖代谢。葡萄籽原花青素激活AMPK途径增加肝脏葡萄糖摄取，限制葡萄糖输出[23]。除此之外，原花青素还可以激活PI3K/Akt胰岛素信号传导途径[24-25]，改善胰岛素信号通路，增加葡萄糖摄取，这种作用同时也靶向外周肌肉组织[24]。血浆游离脂肪酸降低，进一步证实了葡萄籽原花青素对葡萄糖稳态的调节作用，有证据显示增加的游离脂肪酸抑制肌肉细胞蛋白激酶，降低葡萄糖摄取[26]。
脂肪组织分泌的细胞因子脂联素与瘦素与代谢综合征密切相关。脂联素被认为具有改善胰岛素信号传导和动脉粥样硬化的潜在作用[27]，本研究中、高剂量葡萄籽原花青素诱导脂联素升高，提示其具有保护性代谢作用。瘦素主要通过刺激下丘脑，抑制食物摄入、增加能量消耗来调节能量平衡，在常见的肥胖情况下，高瘦素血症与瘦素反应性丧失并存，这种现象被定义为瘦素抵抗[28]。本研究中高剂量葡萄籽原花青素能够降低瘦素水平，可认为其能一定程度恢复瘦素敏感性。
肥胖是一种慢性炎症，研究证明肥大的脂肪组织表达高浓度的促炎蛋白，并且促进巨噬细胞浸润。导致胰岛素抵抗和炎症加剧[29]。本研究中葡萄籽原花青素以剂量依赖性降低血浆炎症因子，提示葡萄籽原花青素有助于降低炎症水平，减轻肥胖和胰岛素抵抗带来的不利影响。
值得一提的是，葡萄籽原花青素减小高糖高脂饮食诱导的肥大棕色脂肪细胞。棕色脂肪是一种消耗能量的脂肪组织，细胞数量以及线粒体含量是棕色脂肪组织发挥产热功能的基础[30]。葡萄籽原花青素干预使棕色脂肪组织细胞数量和线粒体数量都有了明显提升。前期研究显示，葡萄籽原花青素25、50 mg/kg干预3 周可导致高脂饮食诱导下调的棕色脂肪相关线粒体功能基因显著 升高[31]。这表明葡萄籽原花青素可能通过棕色脂肪组织发挥产热作用从而增加能量消耗。
4 结 论
葡萄籽原花青素对代谢综合综合征及其组分具有多重益处。8 周原花青素干预降低了大鼠体质量增长以及体内脂肪堆积，减小了脂肪组织细胞大小，减轻了肝脏脂肪沉积，有效地改善了大鼠的葡萄糖耐量，降低了血脂水平，降低了血浆炎症反应参数。证实了日常膳食摄入原花青素改善代谢综合征及其并发症的可行性。探究原花青素在代谢健康中发挥保护作用的理想剂量有助于更好地了解原花青素在治疗和预防代谢综合征的作用和机制。未来还需要更深入探究原花青素对代谢综合征干预作用机理以及临床实验效果。
参考文献：
[1] ALBERTI K G M M, ECKEL R H, GRUNDY S M, et al. Harmonizing the metabolic syndrome a joint interim statement of the international diabetes federation task force on epidemiology and prevention; national heart, lung, and blood institute; American heart association; world heart federation; international atherosclerosis society; and international association for the study of obesity[J]. Circulation, 2009, 120(16): 1640-1645. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.109.192644.
[2] ALBERTI K G M M, ZIMMET P. The metabolic syndrome: time to reflect[J]. Current Diabetes Reports, 2006, 6(4): 259-261. DOI:10.1007/s11892-006-0057-0.
[3] ALBRINK M J, KRAUSS R M, LINDGREN F T, et al. Intercorrelations among plasma high-density lipoprotein, obesity and triglycerides in a normal population[J]. Lipids, 1980, 15(9): 668-676. DOI:10.1007/BF02534017.
[4] KASSI E, PERVANIDOU P, KALTSAS G, et al. Metabolic syndrome: definitions and controversies[J]. BMC Medicine, 2011, 9: 48. DOI:10.1186/1741-7015-9-48.
[5] ROCHLANI Y, POTHINENI N V, KOVELAMUDI S, et al. Metabolic syndrome: pathophysiology, management, and modulation by natural compounds[J]. Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease, 2017, 11(8): 215-225. DOI:10.1177/1753944717711379.
[6] ZWIETEN P A, MANCIA G, ANESTHESIA V. Background and treatment of metabolic syndrome: a therapeutic challenge[J]. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia, 2006, 10(3): 206-214. DOI:10.1177/1089253206291327.
[7] NOLLET L, TOLDRA F. Handbook of analysis of active compounds in functional foods[M]. Boca Raton: CRC Press, 2012: 10-20. DOI:10.1201/b11653-52.
[8] GIL-CARDOSO K, GINES I, PLNENT M, et al. Chronic supplementation with dietary proanthocyanidins protects from dietinduced intestinal alterations in obese rats[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2017, 61(8): 1-12. DOI:10.1002/mnfr.201601039.
[9] QUESADA H, DEL BAS J M, PAJUELO D, et al. Grape seed proanthocyanidins correct dyslipidemia associated with a high-fat diet in rats and repress genes controlling lipogenesis and VLDL assembling in liver[J]. International Journal of Obesity, 2009, 33(9): 1007-1012. DOI:10.1038/ijo.2009.136.
[10] PASCUAL-SERRANO A, AROLA-ARNAL A, SUAREZGARCLA S, et al. Grape seed proanthocyanidin supplementation reduces adipocyte size and increases adipocyte number in obese rats[J]. International Journal of Obesity, 2017, 41(8): 1246-1255. DOI:10.1038/ijo.2017.90.
[11] MONTAGUT G, BLADE C, BLAY M, et al. Effects of a grapeseed procyanidin extract (GSPE) on insulin resistance[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2010, 21(10): 961-967. DOI:10.1016/j.jnutbio.2009.08.001.
[12] 周中凯, 李莹, 王俊轩, 等. 壳寡糖、抗性淀粉及其复合物对高脂饮食大鼠粪便中脂质成分的差异性[J]. 食品科技, 2016, 41(8): 79-83.
[13] REAGAN-SHAW S, NIHAL M, AHMAD N. Dose translation from animal to human studies revisited[J]. FASEB Journal, 2008, 22(3): 659-661. DOI:10.1096/fj.07-9574LSF.
[14] PANCHAL S K, BROWN L. Rodent models for metabolic syndrome research[J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011, 2011(4): 1-14. DOI:10.1155/2011/351982.
[15] IBARS M, ARDID-RUIZ A, SUAREZ M, et al. Proanthocyanidins potentiate hypothalamic leptin/STAT3 signalling and Pomc gene expression in rats with diet-induced obesity[J]. International Journal of Obesity, 2017, 41(1): 129-136. DOI:10.1038/ijo.2016.169.
[16] SERRANO J, CASANOVA-MARTI A, GIL-CARDOSO K, et al. Acutely administered grape-seed proanthocyanidin extract acts as a satiating agent[J]. Food & Function, 2016, 7(1): 483-490. DOI:10.1039/c5fo00892a.
[17] SUGLYAMA H, AKAZOME Y, SHOJL T, et al. Oligomeric procyanidins in apple polyphenol are main active components for inhibition of pancreatic lipase and triglyceride absorption[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(11): 4604-4609. DOI:10.1021/jf070569k.
[18] DEL BAS J M, RICKETTS M L, BALGES I, et al. Dietary procyanidins lower triglyceride levels signaling through the nuclear receptor small heterodimer partner[J]. Molecular Nutritional & Food Research, 2010, 52(10): 1172-1181. DOI:10.1002/mnfr.200800054.
[19] BASELGA-ESCUDERO L, BLADE C, RLBAS-LATRE A, et al. Chronic supplementation of proanthocyanidins reduces postprandial lipemia and liver miR-33a and miR-122 levels in a dose-dependent manner in healthy rats[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2014, 25(2): 151-156. DOI:10.1016/j.jnutbio.2013.09.014.
[20] BASELGA-ESCUDERO L, PASCUAL-SERRANO A, RLBASLATRE A, et al. Long-term supplementation with a low dose of proanthocyanidins normalized liver miR-33a and miR-122 levels in high-fat diet-induced obese rats[J]. Nutrition Research, 2015, 35(4): 337-345. DOI:10.1016/j.nutres.2015.02.008.
[21] LEE Y A, CHO E J, TANAKA T, et al. Inhibitory activities of proanthocyanidins from persimmon against oxidative stress and digestive enzymes related to diabetes[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 2007, 53(3): 287-292. DOI:10.3177/jnsv.53.287.
[22] KOBAYASHI Y, SUZUKL M, SATSU H, et al. Green tea polyphenols inhibit the sodium-dependent glucose transporter of intestinal epithelial cells by a competitive mechanism[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(11): 5618-5623. DOI:10.1021/jf0006832
[23] CRESCENTL A, DEL BAS J M, AROLA-ARNAL A, et al. Grape seed procyanidins administered at physiological doses to rats during pregnancy and lactation promote lipid oxidation and up-regulate AMPK in the muscle of male offspring in adulthood[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2015, 26(9): 912-920. DOI:10.1016/j.jnutbio.2015.03.003.
[24] PINENT M, CEDO L, MONTAGUT G, et al. Procyanidins improve some disrupted glucose homoeostatic situations: an analysis of doses and treatments according to different animal models[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(7): 569-584. DOI:10.1080/104083 98.2010.501533.
[25] YOGALAKSHML B, BHUVANESWARL S, SREEJA S, et al. Grape seed proanthocyanidins and metformin act by different mechanisms to promote insulin signaling in rats fed high calorie diet[J]. Journal of Cell Communication and Signaling, 2014, 8(1): 13-22. DOI:10.1007/s12079-013-0210-x.
[26] HIRABARA S M, SLLVERLRA L R, ABDULKADER F, et al. Timedependent effects of fatty acids on skeletal muscle metabolism[J]. Journal of Cellular Physiology, 2010, 210(1): 7-15. DOI:10.1002/jcp.20811.
[27] MATSUZAWA Y. Therapy insight: adipocytokines in metabolic syndrome and related cardiovascular disease[J]. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine, 2006, 3(1): 35-42. DOI:10.1038/ncpcardio0380.
[28] ARAGONES G, ARDID-RUIZ A, IBARS M, et al. Modulation of leptin resistance by food compounds[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2016, 60(8): 1789-1803. DOI:10.1002/mnfr.201500964.
[29] JOSEPH S, EDIRISINGHE I, BURTON-FREEMAN B. Fruit polyphenols: a review of anti-inflammatory effects in humans[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2016, 56(3): 419-444. DOI:10.1080/10408398.2013.767221.
[30] 杨帆, 李晓南. 棕色脂肪组织在肥胖与代谢综合征发生发展中的作用及其机制研究[J]. 发育医学电子杂志, 2019, 7(1): 75-80.
[31] PAJUELO D, QUESADA H, DLAZ S, et al. Chronic dietary supplementation of proanthocyanidins corrects the mitochondrial dysfunction of brown adipose tissue caused by diet-induced obesity in Wistar rats[J]. British Journal of Nutrition, 2012, 107(2): 170-178. DOI:10.1017/S0007114511002728.
Effects of Grape Seed Proanthocyanins on High-Fat and High-Sugar Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rats
ZHANG Yanhua, WANG Xiong, WANG Wenli, ZHANG Lei, CHE Huilian, ZHANG Yali*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)
Abstract: In this study, an SD rat model of metabolic syndrome was established by feeding a high-fat and high-sugar diet (HSHF), aiming to explore the effects of grape seed proanthocyanin extract (GSPE) on body mass, blood glucose, insulin sensitivity, serum lipids and inflammation in rats with metabolic syndrome (MetS). The results showed that the HSHF diet-fed rats developed abdominal obesity, impaired glucose tolerance, atherosclerotic dyslipidemia, liver fat deposition and other phenotypes after 24 weeks compared with the control group; and after GSPE (20, 40 and 80 mg/kg mb) intervention in rats for 8 weeks, fasting blood glucose, serum triglyceride, total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol, and the inflammatory cytokines interleukin-6 and tumor necrosis factor-α were significantly reduced, while high-density lipoprotein cholesterol levels were significantly elevated. In addition, hematoxylin-eosin staining analysis showed that GSPE reduced adipose cell size and liver fat deposition. Therefore, GSPE can reduce the body mass of MetS rats, improve blood sugar and lipid metabolism disorders, and reduce serum inflammatory cytokine levels and are expected to be a potential bioactive product for regulating metabolic syndrome.
Keywords: proanthocyanins; obesity; metabolic syndrome; hypolipidemic effect
收稿日期：2019-06-30
基金项目：国家自然科学基金重大项目（C170102）
第一作者简介：张艳华（1996ü ）（ORCID: 0000-0002-6073-7771），女，硕士，研究方向为天然产物与人体健康。E-mail: sandra.1996@163.com
*通信作者简介：张雅丽（1975ü ）（ORCID: 0000-0002-5354-1973），女，副教授，博士，研究方向为天然产物与人体健康。E-mail: zhangyali@cau.edu.cn
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190630-420
中图分类号：TS201.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）01-0112-09
引文格式：
张艳华, 汪雄, 王文利, 等. 葡萄籽原花青素对高脂高糖饮食诱导代谢综合征大鼠干预作用[J]. 食品科学, 2020, 41(1): 112-120. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190630-420. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Yanhua, WANG Xiong, WANG Wenli, et al. Effects of grape seed proanthocyanins on high-fat and high-sugar diet-induced metabolic syndrome in rats[J]. Food Science, 2020, 41(1): 112-120. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190630-420. http://www.spkx.net.cn